[VIP第1年] 指数:3
对一般细胞0.25%胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100mlPBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O/2.9gPO4HNa2,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)2称胰酶0.25g3加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中4调PH7.45仍在冰浴中6过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因为EDTA可以络合Ca2，增加消化效力胰酶在PH值7.2-8.0的时候，溶液呈淡红色。贵州进口胰酶生产企业
使**或细胞片分散成单个细胞，制成细胞悬液用于进一步的实验。影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。加入胰蛋白酶-EDTA溶液，视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润；一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时，弃去细胞消化液，或看见培养瓶壁呈白茫状即可。并加入适量的完全培养液终止消化，吹打分散；如见大量细胞片状脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作。（消化过头，可造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成细胞破碎。由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂，所以加入完全培养基可以终止反应。胰酶配置方法：1、培养液配制，方便好用，对细胞影响小，并且培养液的ph值正好适合胰蛋白酶的溶解2、生理盐水配制，要先调ph值（①胰酶（1：250）克②EDTA-Na③NaCl④KCl⑤Glucose⑥PhenolRed⑦Water1000mL磁力搅拌2-3小时，调pH，过滤**。）3、pbs（：称取胰酶粉末。贵州进口胰酶生产企业胰酶使用的时候要注意什么？
胰酶操作步骤：
(*供参考) ：1. 吸取培养基，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以除去残余的血清。2. 加入适量的胰蛋白酶消化液，略盖过细胞即可。根据细胞的特性可以增加或减少胰酶用量，室温放置30秒至2分钟。（不同的细胞消化时间有所不同）3. 显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用***吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。4. 此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。
胰酶使用注意：1、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被**污染。2、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。贴壁细胞的消化：1、吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清2、加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量。室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同）3、显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用***吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。4、此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解，改变细胞间的连接。培养细胞时，胰酶和双抗该怎么用？
但分子构型有很大区别。沉降系数S20W为，pI=，热稳定性较牛胰蛋白酶稳定，Ca2+对酶的保护作用不及牛羊的明显，无螯合Ca2+的中心部位。有6对二硫键，断裂1~2个键，均不至于破坏酶分子的完整结构而保护了酶的活性。酶的活力分别相当于牛的72%及羊的61%。羊胰蛋白酶与牛、猪的相似，但其活力略高于牛和猪的。胰蛋白酶专一作用有碱性氨基酸精氨酸及赖氨酸羧基所组成的肽键。酶本身很容易自溶，由原先的β-胰蛋白酶酶转化为α-胰蛋白酶，再进一步降解为拟胰蛋白酶，乃至碎片，活力也逐步下降而丧失。除存在于脊椎动物外，还存在于蚕、海盘车、蝲姑、放线菌等范围***的生物体中。另外与高等动物的血液凝固和症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系，可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系，但其特异性则完全不同。胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。***品标准规定按干燥品计算，每1mg的效价不得少于2500单位。由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶。胰酶的使用浓度是多少？贵州进口胰酶生产企业
细胞消化时，胰酶不去除对细胞的影响？贵州进口胰酶生产企业
1、胰酶是，就是说PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。2、EDTA的工作液溶度是－，根据细胞消化的难易程度自己调整。EDTA并不是必须的，容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。如果对贴壁没影响，那么可不离心。3、EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS。4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。5、胰酶和EDTA在pH为8左右的时候**易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。6、胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤**。7、可配2－3乘的胰酶，这样比较节约时间和滤器，用的时候对上**PBS即可。8、储存液放在－20度冰箱冻存，使用液放在4度，用的时候不要放在27度水浴锅温浴，因为这样会让胰酶很快失效，使用前放在室温下一会。贵州进口胰酶生产企业
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